С.Г.Гришутин, Е.И.Дзедзюля, Е.Г.Кондратьева, И.Н.Зоров, О.А.Синицына, А.П.Синицын
ООО «НПК Фермтек», Февраль 2006, Москва.
Введение
Повышение качества кормов и эффективности кормопроизводства путем введения добавок ферментных препаратов для гидролиза некрахмальных полисахаридов (НКП) зерна является прогрессивной и экономически оправданной практикой современного кормопроизводства. Сложность заключается в том, что промышленные ферментные препараты для кормопроизводства почти всегда многокомпонентны, а производители указывают различные, «свои» единицы активности. Для производителя кормов препараты зачастую представляют собой «черный ящик» снабженный приблизительной инструкцией по применению, сильно затрудняется рациональный выбор ферментного препарата, оценка необходимых дозировок. В то же время, полноценное тестирование кормов с добавками разных ферментных препаратов и сравнение эффективности разных дозировок на живой птице в специальных институтах дорого и весьма трудозатратно. В мировой практике применения ферментов, и в том числе на кафедре энзимологии МГУ, в ООО НПК «Фермтек» накоплено достаточно знаний, чтобы с помощью относительно простых инструментальных методов определения активности ферментов рационально обосновать или спрогнозировать эффективность применения того или иного ферментного препарата. Плодотворным представляется и такой подход, когда на основе опыта кормопроизводителя работающего с одним ферментным препаратом делается прогноз относительно эффективности и дозировок других ферментных препаратов, присутствующих на рынке, но опыта работы с которыми нет. Можно рекомендовать те или иные препараты при изменении состава злаков входящих в комбикорм.
Нами тестировались пять сухих ферментных препаратов для гидролиза НКП зерна:
Ксибитен-ксил (предоставлен ООО «Промфермент»)
Ксибитен-цел (предоставлен ООО «Промфермент»)
Кемзайм (предоставлен Компанией Провими)
Ровабио эксел АП (предоставлен Компанией Провими)
Роксазим (предоставлен Компанией Провими).
В данной работе проведено тестирование ферментных препаратов, в том числе:
- определение активностей наиболее значимых ферментов (часть 1, к.х.н. Е.Г.Кондратьева);
- определение оптимумов температуры и рН этих ферментов (часть 2, к.х.н. Е.Г.Кондратьева);
- сравнение термической стабильности ферментов (часть 3, к.б.н. Е.И.Дзедзюля);
- реологический тест по эффективному понижению вязкости компонентов кормов - ржи, ячменя и пшеницы под действием ферменных препаратов (часть 4, к.х.н. С.Г.Гришутин, к.б.н. Е.И.Дзедзюля);
- определение остаточной активности ферментов в кормах и премиксах компании Провими по методике с окрашенными субстратами (часть 5, к.х.н. И.Н.Зоров);
- сравнение свойства фитазных препаратов Натуфос и Кормофит (дополнение, к.х.н. О.А.Синицына).
1. Сравнительная характеристика активности ферментных препаратов.
Задачей данного этапа работы было определение КМЦ-азной (целлюлазной), β-глюканазной и ксиланазной активностей ферментных препаратов в одинаковых условиях (по методикам МГУ).
Важнейшими НКП злаков являются β-глюкан и ксилан. Именно вязкие растворы β-глюканов и арабино-ксиланов, не гидролизуемых в желудочно-кишечном тракте, являются основным источником проблем при скармливании ячменя и ржи, и, отчасти, пшеницы (в зависимости от ее вязкости). Наиболее важны величины активности ферментов определенные именно по этим субстратам. КМЦ-азная активность, также как и активность по фильтровальной бумаге (АФБ) отражает целлюлазную активность ферментных препаратов и характеризует способность препаратов разрушать целлюлозу, входящую в состав клеточной стенки злаков. β-Глюканазная активность характеризует способность ферментного препарата разрушать β-глюкан, ксиланазная активность – разрушать ксилан. КМЦ-азная, β-глюканазная и ксиланазная активности измеряются по скорости расщепления соответствующих полисахаридов до восстанавливающих сахаров (ВС) методом Шомоди-Нельсона, АФБ определяется по скорости накопления ВС из фильтровальной бумаги по ДНС.
Анализируя данные таблицы 1 можно сделать вывод о том, что препарат Ровабио эксел АП является β-глюканазным / ксиланазным препаратом (активности 4810 и 3950 ед/г препарата соответственно). Препарат Ксибитен-цел обладает высокой β-глюканазной активностью (2980 ед/г), а Ксибитен-ксил – высокой ксиланазной активностью (3510 ед/г) и значительной β-глюканазной (1280 ед/г) активностью. Роксазим обладает более низкими активностями (1440 и 920 ед/г по β-глюкану и ксилану). Препарат Кемзайм характеризуется в десятки раз более низкими активностями. Если первые четыре препарата представляют собой достаточно концентрированные продукты с содержанием в них белка в диапазоне 100-200 мг/г (10-20%), то Кемзайм – весьма «разбавленный» препарат с содержанием белка около 11 мг/г (около 1%).
2. Сравнительный анализ оптимальных значений температуры и рН для действия ферментных препаратов.
Задачей данного этапа исследования было определение рН и температурной зависимостей β-глюканазной и ксиланазной активностей ферментных препаратов.
Натуральный рН водной суспензии компонентов корма (злаков) составляет 5,5-6,0 единиц рН. Исходя из этого важно, чтобы ферменты, входящие в состав препаратов, были активны при этом значении рН. Стандартно же (по методикам МГУ) активность измеряется при рН 5,0.
рН и температурная зависимости ксиланазной и β-глюканазной активностей для каждого препарата приведены на рис. 1-5. рН-Оптимумы активностей почти для всех препаратов смещены в кислую область к рН 4,0-5,0, кроме препарата Кемзайм рН, оптимумы обоих активностей которого находятся при рН 5,5. Однако почти все препараты сохраняют значительную долю активности и в диапазоне рН 5,0-6,0 (естественные значения рН комбикорма), и сохраняют активность при кислых значениях рН (естественные значения рН пищеварительного тракта), что позволяет успешно применять их при кормопроизводстве.
Так, рассматривая ксиланазную активность можно сделать вывод, что препараты Ксибитен-ксил и Ксибитен-цел сохраняют 60-100% активности в диапазоне рН 5-6. Кемзайм – 80-100%, Роксазим – 40-70% активности. Ксиланазы препарата Ровабио эксел АП оказались наиболее кислыми и сохраняли 10-50% активности в данном диапазоне рН.
Рассматривая β-глюканазную активность можно заключить, что Ксибитен ксил и Ксибитен-цел сохраняют 55-80% и 65-90% активности в диапазоне рН 5-6. Кемзайм сохраняет 80-100% активности, Рокзазим 35-80% активности а Ровабио эксел АП 40-95% активности в этом диапазоне рН.
В целом рН-зависимости типичны для коммерческих грибных ферментных препаратов, однако следует обратить внимание на более кислый рН оптимум для ксиланаз Ровабио эксел АП. Кроме того, β-глюканаза препаратов Кемзайм и Роксазим и ксиланаза препарата Кемзайм проявляют меньше активности при кислых значениях рН 3,5 по сравнению с другими препаратами.
Температурные оптимумы ксиланазной активности находятся при температуре 50-60°С. Температурные оптимумы β-глюканазной активности выше – 60-65°С. Это говорит о том, что, в целом, β-глюканазная активность более стабильна при повышенной температуре, чем ксиланазная.
Можно ожидать, что идеальные кормовые ферменты должны быть максимально активны при температурах 30-40°С. Однако рост активности с температурой есть фундаментальное свойство ферментов и этот рост ограничивается только нарастающей с температурой термоинактивацией ферментов. Поэтому, величины температурных оптимумов 60-70°С отражают в основном достаточно большую термическую стабильность данной активности, что важно при процессе гранулирования и термообработки кормов. Нужно также отметить, что полученные температурные зависимости типичны для многих коммерческих ферментных препаратов применяемых в кормопроизводстве.
3. Сравнительный анализ стабильности ферментных препаратов при гранулировании. Задачей данного этапа исследования было определение стабильности ксиланазной и β-глюканазной активности ферментных препаратов при 80оС. Данный тест предназначен для имитации условий кратковременного температурного воздействия (термошока), который испытывают ферменты при гранулировании кормов. Тест заключается в инкубации раствора фермента при 80°С в течение 10-120 сек и сравнении устойчивости ксиланаз и β-глюканаз разных препаратов к такому термическому шоку. При этом определяется падение активности во времени (в начальной точке активность принимается равной 100%). Для исследуемых препаратов в качестве критерия используется величина остаточной активности через 20 сек инкубации при 80°С.
Устойчивость ксиланаз разных препаратов к термическому шоку оказалась невысока (рис. 6). Ферменты сохраняли от 8 до 38% активности. Наименее устойчивой оказалась ксиланаза Кемзайма (8%), наиболее устойчивой – ксиланаза Ровабио эксел АП (38%), устойчивость Роксазима (13%), Ксибитена-ксил (22%) и Ксибитена-целл (30%) оказалась промежуточной.
β-Глюканазы разных препаратов оказались, в целом, более устойчивы к термическому шоку, чем ксиланазы (рис.7). Ферменты сохраняли от 22 до 81% активности. Наименее устойчивыми к термошоку оказалась β-глюканаза препарата Ровабио эксел АП (22%). Наиболее устойчивой оказалась β-глюканаза препаратов Ксибитен-ксил (81%) и Ксибитен-цел (71%), устойчивость β-глюканаз Роксазима (35%) и Кемзайма (40%) оказалась промежуточной.
Очевидно, что наибольшие проблемы будет вызывать сохранение ксиланазной активности препаратов при пеллетизации. β-Глюканазная активность термически более устойчива. В целом, этом смысле, предпочтение можно отдать препарата Ксибитен ксил и Ксибетен цел, которые сохраняют больше и β-глюканазную, и ксиланазную активности в условиях термошока.
Однако, как следует из данных раздела 5 (таблица 5), в производственных условиях при гранулировании кормов термостабильность ферментов оказывается выше, чем можно было бы ожидать на основании полученных выше результатов (в условиях, когда ферменты подвергались термическому шоку, находясь в водном растворе). Это можно объяснить тем, что при гранулировании природные субстраты (крахмал, ксиланы, глюканы) злаков, входящих в состав комбикорма, образуют с энзимами специфический фермент-субстратный комплекс, термостабильность которого обычно превышает термостабильность свободных ферментов в растворе.
4. Сравнительный анализ эффективности действия ферментных препаратов на реальные корма и их компоненты «in vitro».
Задачей данного этапа исследования было определение активности ферментных препаратов по изменению реологических характеристик кормов (на основе ржи, ячменя и пшеницы). Работа заключалась в проведении так называемого «Кормотеста по вязкости экстрактов злаков».
Принцип теста заключается в измерении вязкости водного экстракта злаков 200 г/л (рожь, ячмень) или 400 г/л (пшеница) и определении величины снижения вязкости экстракта под действием ферментного препарата, свидетельствующей об эффективности разрушения водорастворимых НПС. Методика теста заключается в использовании навески муки (6 г или 12 г), добавлении расчетного количества воды (30 мл) или раствора ферментного препарата (в дозировках 50, 100, 500 г/ тонну муки) объемом так же 30 мл. Буфер не добавляется, т.е. инкубация происходит при нативном рН суспензии муки. Суспензия муки инкубируется 1 час при 40°С при перемешивании, после чего центрифугируется и, далее, определяется вязкость водного экстракта с помощью капиллярного вискозиметра Оствальда. По результатам измерения рассчитывается относительная вязкость, которая показывает во сколько раз экстракт более вязкий, чем вода:
Относительная вязкость (RelV) = вязкость экстракта муки / вязкость воды,
Вязкость водных экстрактов ржи. Наибольшая вязкость характерна для экстрактов ржи. Вязкость зависит от сорта и возраста зерна. В нашем случае относительная вязкость экстракта ржи без добавления ферментов составляла 24, т.е. его вязкость в 24 раза превышает вязкость воды. Известно, что высокая вязкость экстрактов ржи обусловлена высокомолекулярными арабиноксиланами и целевой активностью кормовых ферментных препаратов для ржи является ксиланазная активность. Действие всех препаратов приводило к значительному снижению относительной вязкости водных экстрактов ржи (см. рис. 8).
Наименее эффективным оказался препарат Кемзайм, что соответствует его низкой ксиланазной активности (см. таблицу 1). Наиболее эффективными были два препарата – Ровабио эксел АП и Ксибитен-цел. Данные, показанные на рис. 8 позволяют сравнивать эффективность действия препарата в разных дозировках. Однако нужно отметить, что по результатам данного теста, нельзя сказать какое именно снижение вязкости является достаточным при практическом применении в кормопроизводстве, поскольку это зависит от многих факторов реальной технологии и состава корма. Можно лишь создать сравнительную шкалу эффективности разных препаратов.
Отметим, что высокая ксиланазная активность препарата является важной, однако не всегда определяющей мерой для оценки эффективности его действия. Дело в том, что во ржи, пшенице, ячмене и других злаках присутствуют белковые ингибиторы ксиланаз, которые в большинстве случаев сильно подавляют активность ксиланаз, содержащихся в ферментных препаратах. Известны лишь единичные примеры ксиланаз, не ингибируемых белковыми ингибиторами злаков. Вопрос об устойчивости ксиланаз к ингибиторам из злаков возник относительно недавно, поэтому производители пока не сообщают об устойчивости ксиланаз их препаратов к ингибиторам. Конечно, вопрос о влиянии белковых ингибиторах стоит особенно остро случае не подвергавшихся термообработке кормов (термообработка может приводить к разрушению белковых ингибиторов).
Влияние ингибирования ксиланазной активности можно проиллюстрировать на примере Ксибитена-ксил и Кибитена-цел. В нашей лаборатории ранее изучался состав ферментов этих препаратов, который имеет следующие особенности. Активность Ксибитена–цел в основном (на 50-80%) обусловлена эндо-глюканазой, которая проявляет неспецифическую ксилазную активность и нечувствительна к действию ингибиторов ржи, ячменя, пшеницы и кукурузы. В отличие от этого, ксиланазная активность Ксибитена-ксил на 95% и более обусловлена собственно ксиланазой, которая сильно ингибируется белками из экстрактов злаков. Поэтому получается, что ксиланазные единицы Ксибитена-цел намного более эффективны (в 20-100 раз), чем у Ксибетен-ксил и, несмотря на значительное преимущество Ксибитена-ксил в величине ксиланазной активности, его действие на рожь сравнимо с действием Ксибитена-цел.
Величина загружаемой активности, которая соответствует весовым дозировкам препаратов, приведена в таблице 2 и позволяет оценить, в сочетании с данными рис. 8, сравнительную эффективность ксиланазных единиц разных препаратов. Приблизительно одинаковый уровень уменьшения вязкости экстрактов ржи (около 40%) достигается при загрузке общей ксиланазной активности Ксибетен-цел, Ксибетен-ксил, Ровабио эксел АП и Роксазима, соответственно, 79300, 1756000, 79300, 197250 и 461000 единиц на тонну ржи (Кемзайм при использованных дозировках не обеспечивал 40% уменьшения вязкости).
Вязкость водных экстрактов пшеницы. Вязкость экстрактов пшеницы существенно меньше чем у ржи. Для надежной детекции изменений вязкости экстракта мы увеличили концентрацию муки до 400 г/л. При этом получатся экстракт всего в 2 раза более вязкий чем вода. Известно, что вязкость экстрактов пшеницы обусловлена, в основном, растворимыми арабиноксиланами, хотя растворимые бета-глюканы также вносят вклад в вязкость.
Влияние разных ферментных препаратов на фоне низкой исходной вязкости пшеницы сказывается слабее, чем в случае высоковязких экстрактов ржи. Однако тенденция по сравнительной эффективности действия большинства препаратов, кроме Ровабио эксел АП та же что и в случае ржи (ср. рис. 8 и рис. 9). То есть действие Ксибитена-цел (100 г/т) сравнимо с Ксибитеном-ксил (500 г/т) и Роксазимом (примерно 100 г/т); для Кемзайма требуются, очевидно, дозы выше 500 г/т для достижения того же эффекта снижения вязкости. Единственным исключением является Ровабио эксел АП который в случае пшеницы повышает вязкость ее водных экстрактов. Такой эффект отмечался нами и ранее для некоторых ферментных препаратов. Этому явлению сложно дать однозначное объяснение. В литературе высказывается мнение о том, что некоторые ксиланазы более специфичны к арабиноксиланам, находящимся в нерастворимой форме в зерне. Таким образом, в первую очередь эти ферменты способствуют разрушению и частичному растворению фракции нерастворимых арабиноксиланов, что приводит к повышению вязкости. Затем вязкость снижается из-за разрушения растворенных арабиноксиланов. Вероятно, однако, что в данном случае действует какие-либо побочные активности Ровабио эксел АП, например, протеазная или амилазная, которые способствуют растворению глютена и крахмала, соответственно. Нужно подчеркнуть, что вязкость экстрактов обработанной Ровабио эксел АП муки с увеличением дозы сначала достоверно повышается, а затем, при больших дозах, начинает снижаться.
Вязкость водных экстрактов ячменя. Вязкость экстрактов ячменя значительно выше чем у пшеницы, но меньше чем у ржи. Концентрация муки составляла 200 г/л. При этом получатся экстракт в 4,3 раза более вязкий, чем вода. Известно, что вязкость экстрактов ячменя, в отличие от ржи и пшеницы обусловлена, в основном, растворимыми β-глюканами.
Наиболее значимыми активностями ферментных препаратов в данном случае будут β-глюканазная или КМЦ-азная. Карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) хотя и не является естественным субстратом для этих ферментов, но неплохо заменяет β-глюкан и является широко-распространенным модельным субстратом для эндо-глюканаз, которые обладают одновременно β-глюканазой и КМЦ-азной активностями.
Действие всех ферментных препаратов приводило к заметному снижению вязкости (рис. 11). Наиболее эффективными были препараты Ксибетен-цел и Ровабио эксел АП. Препараты Ксибетен-цел и Роксазим были близки по эффективности к двум упомянутым выше препаратам. Наименее эффективным был Кемзайм.
Заключение
Проведено тестирование и сравнение пяти коммерческих ферментных препаратов β-глюканаз (целлюлаз) и ксиланаз для кормопроизводства. При этом были использованы современные инструментальные методы определения характеристик ферментов, используемых для гидролиза НКП зерна и критически важных при производстве кормов с ферментными добавками. Использованы также оригинальные методики МГУ и ООО НПК «Фермтек», которые позволяют тестировать реальные образцы кормов или их компонентов и сравнивать эффективность снижения вязкости корма или определять реальную остаточную активность ферментов в готовом корме, комплексно учитывать процессы термоинактивации и ингибирования ферментов. Методики просты в использовании и могут применяться для рутинного тестирования в лабораториях на кормопроизводстве или же при разработке и мониторинге новых рецептур комбикормов.
на ленту новостей